国内女人喷潮完整视频,免费看三片在线播放,国产人妻互换一区二区水牛影视,最新吃瓜爆料免费观看

物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收波長(zhǎng),以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后,可用同樣條件將該供試品配成溶液,測(cè)定其吸收度,即可由上式計(jì)算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見(jiàn)光區(qū),除某些物質(zhì)對(duì)光有吸收外,很多物質(zhì)本身并沒(méi)有吸收,但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過(guò)處理使其顯色后再測(cè)定,故又稱(chēng)比色分析。由于顯色時(shí)影響呈色深淺的因素較多,且常使用單色光純度較差的儀器,故測(cè)定時(shí)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吠瑫r(shí)操作。

分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。常用于核酸,蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量。儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測(cè)器、信號(hào)處理器和顯示與存儲(chǔ)系統(tǒng)組成。

核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)260 nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一,因此其換算系數(shù)不同。定量不同類(lèi)型的核酸,事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。如:1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數(shù)的換算,從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測(cè)試前,選擇正確的程序,輸入原液和稀釋液的體積,爾后測(cè)試空白液和樣品液。然而,實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者最頭痛的問(wèn)題。靈敏度越高的儀器,表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。

事實(shí)上,分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理,允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,即儀器有一定的準(zhǔn)確度和精確度。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%(1A)。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng),都是正常的。另外,還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,離子濃度等:在測(cè)試時(shí),離子濃度太高,也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移,因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,如TE,可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。為了最大程度減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi),顆粒的干擾相對(duì)較小,結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過(guò)低,或者過(guò)高(超過(guò)光度計(jì)的測(cè)試范圍)。最后是操作因素,如混合要充分,否則吸光值太低,甚至出現(xiàn)負(fù)值;混合液不能存在氣泡,空白液無(wú)懸浮物,否則讀數(shù)漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品,否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致

除了核酸濃度,分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度,如A260/A280的比值,用于評(píng)估樣品的純度,因?yàn)榈鞍椎奈�收峰�?80nm。純凈的樣品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類(lèi)物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子。

這種方法是在280nm波長(zhǎng),直接測(cè)試蛋白。選擇Warburg 公式,光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應(yīng)的換算方法,將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過(guò)程非常簡(jiǎn)單,先測(cè)試空白液,然后直接測(cè)試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),一般要消除320nm 的"背景"信息,設(shè)定此功能"開(kāi)"。與測(cè)試核酸類(lèi)似,要求A280的吸光值至少大于0.1A,最佳的線(xiàn)性范圍在1.0-1.5 之間。實(shí)驗(yàn)中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時(shí),發(fā)現(xiàn)讀數(shù)"漂移"。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上,只要觀(guān)察A280的吸光值的變化范圍不超過(guò)1%,表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因?yàn)閃arburg 公式吸光值換算成濃度,乘以一定的系數(shù),只要吸光值有少許改變,濃度就會(huì)被放大,從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法,適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō),速度快,操作簡(jiǎn)單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。

蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物,比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。

總述

一般有BCA,Bradford,Lowry 等幾種方法。

Lowry法

以最早期的Biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ),并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2 反應(yīng),產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與Biuret 相比,Lowry 法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑;反應(yīng)需要的時(shí)間較長(zhǎng);容易受到非蛋白物質(zhì)的影響;含EDTA,Triton x-100,ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。

BCA

(Bicinchoninine acid assay)法:這是一種較新的、更敏感的蛋白測(cè)試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2 反應(yīng)產(chǎn)生Cu ,后者與BCA形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在562nm波長(zhǎng)。此化合物與蛋白濃度的線(xiàn)性關(guān)系極強(qiáng),反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對(duì)于Lowry法,操作簡(jiǎn)單,敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。

布拉德福德法

這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng),產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點(diǎn)是,敏感度好,是Lowry 和BCA 兩種測(cè)試方法的2 倍;操作更簡(jiǎn)單,速度更快;只需要一種反應(yīng)試劑;化合物可以穩(wěn)定1小時(shí),方便結(jié)果;而且與一系列干擾Lowry,BCA 反應(yīng)的還原劑(如DTT,巰基乙醇)相容。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的。

某些初次接觸比色法測(cè)定的研究者可能為各種比色法測(cè)出的結(jié)果并不一致,感到迷惑,究竟該相信哪種方法?由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一,所以同時(shí)使用幾種方法對(duì)同一樣品得出的樣品濃度無(wú)可比性。例如:Keller等測(cè)試人奶中的蛋白,結(jié)果Lowry,BCA 測(cè)出的濃度明顯高于Bradford,差異顯著。即使是測(cè)定同一樣品,同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致,測(cè)試后的濃度也不一致。如用Lowry測(cè)試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì),以BSA作標(biāo)準(zhǔn)品,濃度1.34mg/ml,以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品,濃度2.64mg/ml。因此,在選擇比色法之前,最好是參照要測(cè)試的樣本的化學(xué)構(gòu)成,尋找化學(xué)構(gòu)成類(lèi)似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。另外,比色法定量蛋白質(zhì),經(jīng)常出現(xiàn)的問(wèn)題是樣品的吸光值太低,導(dǎo)致測(cè)出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大。關(guān)鍵問(wèn)題是,反應(yīng)后1011分光光度計(jì)的重要配件—— 比色杯的顏色是有一定的半衰期,所以每種比色法都列出了反應(yīng)測(cè)試時(shí)間,所有的樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)樣品),都必須在此時(shí)間內(nèi)測(cè)試。時(shí)間過(guò)長(zhǎng),得到的吸光值變小,換算的濃度值降低。除此,反應(yīng)溫度、溶液PH值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因。此外,非常重要的是,最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯,因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會(huì)讓石英或者玻璃著色

1、接通電源,打開(kāi)儀器開(kāi)關(guān),掀開(kāi)樣品室暗箱蓋,預(yù)熱10分鐘。

2、將靈敏度開(kāi)關(guān)調(diào)至"1"檔(若零點(diǎn)調(diào)節(jié)器調(diào)不到"0"檔時(shí),需選用較高檔。)

3、根據(jù)所需波長(zhǎng)轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)選擇鈕。

4、將空白液及測(cè)定液分別倒入比色杯3/4處,用擦鏡紙擦清外壁,放入樣品室內(nèi),使空白管對(duì)準(zhǔn)光路。

5、在暗箱蓋開(kāi)啟狀態(tài)下調(diào)節(jié)零點(diǎn)調(diào)節(jié)器,使讀數(shù)盤(pán)指針指向t=0處。

6、蓋上暗箱蓋,調(diào)節(jié)"100"調(diào)節(jié)器,使空白管的t=100,指針?lè)�(wěn)定后逐步拉出樣品滑竿,分別讀出測(cè)定管的光密度值,并記錄。

7、比色完畢,關(guān)上電源,取出比色皿洗凈,樣品室用軟布或軟紙擦凈。

比色杯按照材質(zhì)大致分為石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根據(jù)不同的測(cè)量體積,有比色杯和毛細(xì)比色杯等。一般測(cè)試核酸和紫外定量蛋白,均采用石英杯或者玻璃杯,但是不適合比色法測(cè)定。因?yàn)榉磻?yīng)中的染料(如考馬斯亮蘭)能讓石英和玻璃著色,所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內(nèi)測(cè)試樣品。

由于另外測(cè)試的樣品量不同,所以一般分光光度計(jì)廠(chǎng)家提供不同容積的比色杯以滿(mǎn)足用戶(hù)不同的需求。市場(chǎng)已經(jīng)存在一種既可用于核酸、紫外蛋白質(zhì)定量,亦可用于蛋白比色法測(cè)定的塑料杯,樣品用量?jī)H需50μl,比色杯單個(gè)無(wú)菌包裝,可以回收樣品。如Eppendorf UVette®塑料比色杯,是比色杯市場(chǎng)上一個(gè)革新。隨著生命科學(xué)以及相關(guān)學(xué)科發(fā)展,對(duì)此類(lèi)科學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究提出更高的要求,分光光度計(jì)將是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室不可缺少的儀器,也成為微生物、食品、制藥等相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的必備設(shè)備之一。

分光光度計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源,通過(guò)系列分光裝置,從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源,光源透過(guò)測(cè)試的樣品后,部分光源被吸收,計(jì)算樣品的吸光值,從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長(zhǎng)密度和生長(zhǎng)期,多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測(cè)推斷細(xì)菌的生長(zhǎng)密度。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn),需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液,之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作,必須針對(duì)每種微生物和每臺(tái)儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),做出校正曲線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)中偶爾會(huì)出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值,原因是采用了顯色的培養(yǎng)基,即細(xì)菌培養(yǎng)一段時(shí)間后,與培養(yǎng)基反應(yīng),發(fā)生變色反應(yīng)。另外,需要注意的是,測(cè)試的樣品不能離心,保持細(xì)菌懸浮狀態(tài)。

1、該儀器應(yīng)放在干燥的房間內(nèi),使用時(shí)放置在堅(jiān)固平穩(wěn)的工作臺(tái)上,室內(nèi)照明不宜太強(qiáng)。熱天時(shí)不能用電扇直接向儀器吹風(fēng),防止燈泡燈絲發(fā)亮不穩(wěn)定。

2、使用本儀器前,使用者應(yīng)該首先了解本儀器的結(jié)構(gòu)和工作原理,以及各個(gè)操縱旋鈕之功能。在未按通電源之前,應(yīng)該對(duì)儀器的安全性能進(jìn)行檢查,電源接線(xiàn)應(yīng)牢固,通電也要良好,各個(gè)調(diào)節(jié)旋鈕的起始位置應(yīng)該正確,然后再按通電源開(kāi)關(guān)。

3、在儀器尚未接通電源時(shí),電表指針必須于"0"刻線(xiàn)上,若不是這種情況,則可以用電表上的校正螺絲進(jìn)行調(diào)節(jié)。

《2014-2018年中國(guó)分光光度計(jì)行業(yè)調(diào)查及市場(chǎng)咨詢(xún)研究報(bào)告》報(bào)告主要分析了分光光度計(jì)的市場(chǎng)規(guī)模、分光光度計(jì)產(chǎn)品供需求狀況、分光光度計(jì)競(jìng)爭(zhēng)狀況和分光光度計(jì)主要企業(yè)經(jīng)營(yíng)情況、分光光度計(jì)主要企業(yè)的市場(chǎng)占有率,同時(shí)對(duì)分光光度計(jì)的未來(lái)發(fā)展做出科學(xué)的預(yù)測(cè)。