光度計

分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸,蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統(tǒng)組成。
事實上,分光光度計的設(shè)計原理和工作原理,允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,即儀器有一定的準(zhǔn)確度和精確度。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%(1A)。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動,都是正常的。另外,還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,離子濃度等:在測試時,離子濃度太高,也會導(dǎo)致讀數(shù)漂移,因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,如TE,可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi),顆粒的干擾相對較小,結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低,或者過高(超過光度計的測試范圍)。最后是操作因素,如混合要充分,否則吸光值太低,甚至出現(xiàn)負(fù)值;混合液不能存在氣泡,空白液無懸浮物,否則讀數(shù)漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品,否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致
除了核酸濃度,分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度,如A260/A280的比值,用于評估樣品的純度,因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。
一般有BCA,Bradford,Lowry 等幾種方法。
Lowry法
以最早期的Biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ),并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2 反應(yīng),產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與Biuret 相比,Lowry 法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑;反應(yīng)需要的時間較長;容易受到非蛋白物質(zhì)的影響;含EDTA,Triton x-100,ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。
BCA
(Bicinchoninine acid assay)法:這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2 反應(yīng)產(chǎn)生Cu ,后者與BCA形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系極強,反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于Lowry法,操作簡單,敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。
布拉德福德法
這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng),產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點是,敏感度好,是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍;操作更簡單,速度更快;只需要一種反應(yīng)試劑;化合物可以穩(wěn)定1小時,方便結(jié)果;而且與一系列干擾Lowry,BCA 反應(yīng)的還原劑(如DTT,巰基乙醇)相容。但是對于去污劑依然是敏感的。
某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結(jié)果并不一致,感到迷惑,究竟該相信哪種方法?由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一,所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如:Keller等測試人奶中的蛋白,結(jié)果Lowry,BCA 測出的濃度明顯高于Bradford,差異顯著。即使是測定同一樣品,同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致,測試后的濃度也不一致。如用Lowry測試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì),以BSA作標(biāo)準(zhǔn)品,濃度1.34mg/ml,以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品,濃度2.64mg/ml。因此,在選擇比色法之前,最好是參照要測試的樣本的化學(xué)構(gòu)成,尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。另外,比色法定量蛋白質(zhì),經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低,導(dǎo)致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關(guān)鍵問題是,反應(yīng)后1011分光光度計的重要配件—— 比色杯的顏色是有一定的半衰期,所以每種比色法都列出了反應(yīng)測試時間,所有的樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)樣品),都必須在此時間內(nèi)測試。時間過長,得到的吸光值變小,換算的濃度值降低。除此,反應(yīng)溫度、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因。此外,非常重要的是,最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯,因為反應(yīng)后的顏色會讓石英或者玻璃著色
2、將靈敏度開關(guān)調(diào)至"1"檔(若零點調(diào)節(jié)器調(diào)不到"0"檔時,需選用較高檔。)
3、根據(jù)所需波長轉(zhuǎn)動波長選擇鈕。
4、將空白液及測定液分別倒入比色杯3/4處,用擦鏡紙擦清外壁,放入樣品室內(nèi),使空白管對準(zhǔn)光路。
5、在暗箱蓋開啟狀態(tài)下調(diào)節(jié)零點調(diào)節(jié)器,使讀數(shù)盤指針指向t=0處。
6、蓋上暗箱蓋,調(diào)節(jié)"100"調(diào)節(jié)器,使空白管的t=100,指針穩(wěn)定后逐步拉出樣品滑竿,分別讀出測定管的光密度值,并記錄。
7、比色完畢,關(guān)上電源,取出比色皿洗凈,樣品室用軟布或軟紙擦凈。
由于另外測試的樣品量不同,所以一般分光光度計廠家提供不同容積的比色杯以滿足用戶不同的需求。市場已經(jīng)存在一種既可用于核酸、紫外蛋白質(zhì)定量,亦可用于蛋白比色法測定的塑料杯,樣品用量僅需50μl,比色杯單個無菌包裝,可以回收樣品。如Eppendorf UVette®塑料比色杯,是比色杯市場上一個革新。隨著生命科學(xué)以及相關(guān)學(xué)科發(fā)展,對此類科學(xué)的實驗研究提出更高的要求,分光光度計將是分子生物學(xué)實驗室不可缺少的儀器,也成為微生物、食品、制藥等相關(guān)實驗室的必備設(shè)備之一。
2、使用本儀器前,使用者應(yīng)該首先了解本儀器的結(jié)構(gòu)和工作原理,以及各個操縱旋鈕之功能。在未按通電源之前,應(yīng)該對儀器的安全性能進(jìn)行檢查,電源接線應(yīng)牢固,通電也要良好,各個調(diào)節(jié)旋鈕的起始位置應(yīng)該正確,然后再按通電源開關(guān)。
3、在儀器尚未接通電源時,電表指針必須于"0"刻線上,若不是這種情況,則可以用電表上的校正螺絲進(jìn)行調(diào)節(jié)。
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