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濃縮膠的作用是有堆積作用,凝膠濃度較小,孔徑較大,把較稀的樣品加在濃縮膠上,經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。當樣品液和濃縮膠選pH6.8的TRIS/HCL緩沖液,電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始后,HCL解離成氯離子,甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負電荷,因此一起向正極移動,其中氯離子最快,甘氨酸根離子最慢,蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大,超過蛋白,因此在后面形成低電導區(qū),而電場強度與低電導區(qū)成反比,因而產(chǎn)生較高的電場強度,使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動,形成以穩(wěn)定的界面,使蛋白聚集在移動界面附近,濃縮成一中間層。大大提高了電泳的靈敏度。

一般同工酶可選擇7?5%~10%的膠(過氧化物酶和酯酶7?5%較合適,超氧化物歧化酶用10%,可溶性蛋白可根據(jù)需要配制)。將配制好的凝膠液置真空干燥器中,抽氣10Min,再加入TEMED15μl;混勻后用一細玻棒引流,沿無凹槽的玻板緩緩注入膠室中,注膠過程要防止氣泡產(chǎn)生。膠液加到離凹槽3CM處為止,立即用注射器輕輕在膠溶液上面鋪1CM高的水層,但不要擾亂丙烯酰胺膠面。待分離膠和水層之間出現(xiàn)清晰的界面時,表示聚合已完成。用注射器小心吸出上層覆蓋水,按表5-1配制好濃縮膠,抽氣后加入5μlTEMED,混合后加到分離膠上層,插入預先選擇好的樣品梳,注意不要帶入氣泡。

類別分離膠濃縮膠

T%57.51012.51517.520330%Acr5.07.39.7512.3214.8817.420.011%Bis45.67.55.43.53.531分離膠緩沖液3.753.753.753.753.753.753.75-濃縮膠緩沖液——————-2.5重蒸水17.0513.158.88.337.675.153.055.4310%AP0.20.20.20.20.20.20.20.07注:分離膠30Ml,濃縮膠10Ml,可根據(jù)需要,按比例增減各成分的體積。

樣品制備采小麥幼苗上數(shù)第一展開葉,取中部,除去葉脈,準確稱取1g,加入少量提樣緩沖液,置冰浴研磨勻漿后定容至5Ml,10000r/Min離心15Min,上清液為可溶性蛋白質(zhì)的粗提液。取此液0?5Ml加入等體積樣品處理液,混勻后貯于冰箱備用。

1、將制好的凝膠板夾在電泳槽上,向上下槽注入電極緩沖液,取下樣品梳(注意不要拉斷樣槽隔墻)。將微量進樣器針頭插入樣槽下部慢慢進樣,每槽點樣15~20μl。

2、上槽接負極,下槽接正極,接通電源,電流調(diào)至15~20MA,電壓為200V,電泳至溴酚藍標志到達凝膠前沿為止,將電流、電壓調(diào)至零后斷電。

3、電泳結束后,取下玻板,揭掉膠布,抽出夾條,將兩塊玻板置自來水龍頭下,借助水流,用解剖刀柄輕輕從板側縫間撬開玻板(注意切忌從凹槽處撬),將膠放入染色液中。

1、過氧化物酶染色稱取0?1g聯(lián)苯胺,加少量無水乙醇溶解,依次加入5Mol/LHAC10Ml,1?5Mol/LNAAC10Ml,H2O70Ml,最后加入3~5滴H2O2。將此顯色液傾入20CM培養(yǎng)皿中,待電泳凝膠片加入后不斷攪動,觀察各條帶顯色的先后,照相或用鉛筆畫出過氧化物酶同工酶譜。最后用7%醋酸固定(注意色帶在HAC溶液中容易退色,固定時間不宜過長),拍照或制成干膠片保存結果。

2、酯酶同工酶顯色 稱取50Mgα-醋酸萘酯,50Mgβ-醋酸萘酯,100Mg堅牢藍RR(或堅牢藍B),先用約5Ml丙酮溶解,再用0?1Mol/LPH5?0的磷酸緩沖液稀釋到150Ml,將膠板浸入100Ml此液中,室溫下顯色約20Min,可看到桃紅色的磷酸酯酶同工酶區(qū)帶。棄去染色液,用蒸餾水漂洗,再用7%HAC固定。

3、超氧化物歧化酶染色 染色液組成:氮藍四唑(NBT)25μMol/L;核黃素0?01%;50MMol/LPH7?8磷酸緩沖液(含1MMol/LEDTA)。染色時,將準備好的電泳膠板放入盛有80MlNBT溶液(根據(jù)膠板大小加減溶液用量)的培養(yǎng)皿中,浸泡15Min后,換核黃素溶液浸泡5Min;然后將膠板放入含有1MMol/LEDTA的PH7?8磷酸緩沖液中,在距膠板10CM高度用40W日光燈直射膠面,直至藍色背景上出現(xiàn)透明條帶為止。

4、過氧化氫酶同工酶染色 染色液的組成:A液為3%H2O225Ml,0?1Mol/LPH7?0磷酸緩沖液5Ml,0?1Mol/LNA2S2O33?5Ml;B液為0?09Mol/LKI25Ml加蒸餾水25Ml。先將準備好的電泳膠板浸泡在A液中,室溫下放置15Min,倒出A液,用蒸餾水徹底沖洗干凈,加入B液,酶活性表現(xiàn)在藍色背景上的白色區(qū)帶。蒸餾水漂洗后用10%甘油固定。

5、可溶性蛋白的染色稱取0?2g考馬斯亮藍R250,用少量無水乙醇溶解,用含有40%乙醇和7%醋酸的水溶液稀釋至200Ml。將膠板浸入此液室溫下染色5~6H,倒去染色液,用水沖洗附著于膠面的染料,再將膠浸入脫色液中(400Ml乙醇,70Ml冰醋酸加水到1000Ml)更換脫色液幾次,直到背景清晰為止。

6、結果保存將脫過色的凝膠照相或掃描后作為實驗報告的憑證。作為學生實驗報告可用繪圖或制作干膠的方法記錄酶譜帶或可溶性蛋白質(zhì)的主要譜帶或用干膠片保存結果。方法如下:

干膠制備:裁下2張比膠片四邊長3CM左右的玻璃紙在水中浸濕后,先將一張平鋪在玻璃板上,放上凝膠片,再蓋上另一張,用玻棒趕走氣泡,將玻璃紙邊緣折向玻板底部,用另一塊同樣大小的玻璃板壓住,再用夾子夾住兩端固定,室溫下避光放置1天左右即可,然后取下干膠,修剪整齊保存。

繪圖表示:將各酶帶按顏色深淺繪成譜帶圖。

1、SOD同工酶電泳時,分離膠濃度應選擇10%,樣品提取液用50MMol/LPH7?8的磷酸緩沖液比較理想。

2、ACr和BIs是神經(jīng)性毒劑,且對皮膚有刺激作用。配制貯液、配膠、灌膠操作時,要戴上醫(yī)用乳膠手套或指套,避免與皮膚接觸。只要細心操作,一般不會引起損傷。

3、ACr和BIs的純化。精確的定量分析和制備電泳需要純度更高的ACr和BIs,其提純方法如下:

(1)ACr重結晶方法 將ACr溶于50℃氯仿中(70g/L),趁熱過濾,濾液冷卻至-20℃,結晶。用冷的布氏漏斗抽濾,收集結晶?用冷氯仿淋洗結晶,真空干燥。純ACr的熔點為84?5±0?3℃。

(2)BIs重結晶方法 將12gBIs溶于1000Ml40~50℃的丙酮中,趁熱過濾,濾液逐漸冷卻至20℃,用冷的布氏漏斗抽濾,收集結晶。用冷丙酮淋洗,真空干燥。純BIs的熔點為185℃。