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濃縮膠的作用是有堆積作用,凝膠濃度較小,孔徑較大,把較稀的樣品加在濃縮膠上,經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個(gè)狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品液和濃縮膠選pH6.8的TRIS/HCL緩沖液,電極液選TRIS/甘氨酸。電泳開始后,HCL解離成氯離子,甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷,因此一起向正極移動(dòng),其中氯離子最快,甘氨酸根離子最慢,蛋白居中。電泳開始時(shí)氯離子泳動(dòng)率最大,超過蛋白,因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū),而電場(chǎng)強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比,因而產(chǎn)生較高的電場(chǎng)強(qiáng)度,使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動(dòng),形成以穩(wěn)定的界面,使蛋白聚集在移動(dòng)界面附近,濃縮成一中間層。大大提高了電泳的靈敏度。

一般同工酶可選擇7?5%~10%的膠(過氧化物酶和酯酶7?5%較合適,超氧化物歧化酶用10%,可溶性蛋白可根據(jù)需要配制)。將配制好的凝膠液置真空干燥器中,抽氣10Min,再加入TEMED15μl;混勻后用一細(xì)玻棒引流,沿?zé)o凹槽的玻板緩緩注入膠室中,注膠過程要防止氣泡產(chǎn)生。膠液加到離凹槽3CM處為止,立即用注射器輕輕在膠溶液上面鋪1CM高的水層,但不要擾亂丙烯酰胺膠面。待分離膠和水層之間出現(xiàn)清晰的界面時(shí),表示聚合已完成。用注射器小心吸出上層覆蓋水,按表5-1配制好濃縮膠,抽氣后加入5μlTEMED,混合后加到分離膠上層,插入預(yù)先選擇好的樣品梳,注意不要帶入氣泡。

類別分離膠濃縮膠

T%57.51012.51517.520330%Acr5.07.39.7512.3214.8817.420.011%Bis45.67.55.43.53.531分離膠緩沖液3.753.753.753.753.753.753.75-濃縮膠緩沖液——————-2.5重蒸水17.0513.158.88.337.675.153.055.4310%AP0.20.20.20.20.20.20.20.07注:分離膠30Ml,濃縮膠10Ml,可根據(jù)需要,按比例增減各成分的體積。

樣品制備采小麥幼苗上數(shù)第一展開葉,取中部,除去葉脈,準(zhǔn)確稱取1g,加入少量提樣緩沖液,置冰浴研磨勻漿后定容至5Ml,10000r/Min離心15Min,上清液為可溶性蛋白質(zhì)的粗提液。取此液0?5Ml加入等體積樣品處理液,混勻后貯于冰箱備用。

1、將制好的凝膠板夾在電泳槽上,向上下槽注入電極緩沖液,取下樣品梳(注意不要拉斷樣槽隔墻)。將微量進(jìn)樣器針頭插入樣槽下部慢慢進(jìn)樣,每槽點(diǎn)樣15~20μl。

2、上槽接負(fù)極,下槽接正極,接通電源,電流調(diào)至15~20MA,電壓為200V,電泳至溴酚藍(lán)標(biāo)志到達(dá)凝膠前沿為止,將電流、電壓調(diào)至零后斷電。

3、電泳結(jié)束后,取下玻板,揭掉膠布,抽出夾條,將兩塊玻板置自來水龍頭下,借助水流,用解剖刀柄輕輕從板側(cè)縫間撬開玻板(注意切忌從凹槽處撬),將膠放入染色液中。

1、過氧化物酶染色稱取0?1g聯(lián)苯胺,加少量無水乙醇溶解,依次加入5Mol/LHAC10Ml,1?5Mol/LNAAC10Ml,H2O70Ml,最后加入3~5滴H2O2。將此顯色液傾入20CM培養(yǎng)皿中,待電泳凝膠片加入后不斷攪動(dòng),觀察各條帶顯色的先后,照相或用鉛筆畫出過氧化物酶同工酶譜。最后用7%醋酸固定(注意色帶在HAC溶液中容易退色,固定時(shí)間不宜過長),拍照或制成干膠片保存結(jié)果。

2、酯酶同工酶顯色 稱取50Mgα-醋酸萘酯,50Mgβ-醋酸萘酯,100Mg堅(jiān)牢藍(lán)RR(或堅(jiān)牢藍(lán)B),先用約5Ml丙酮溶解,再用0?1Mol/LPH5?0的磷酸緩沖液稀釋到150Ml,將膠板浸入100Ml此液中,室溫下顯色約20Min,可看到桃紅色的磷酸酯酶同工酶區(qū)帶。棄去染色液,用蒸餾水漂洗,再用7%HAC固定。

3、超氧化物歧化酶染色 染色液組成:氮藍(lán)四唑(NBT)25μMol/L;核黃素0?01%;50MMol/LPH7?8磷酸緩沖液(含1MMol/LEDTA)。染色時(shí),將準(zhǔn)備好的電泳膠板放入盛有80MlNBT溶液(根據(jù)膠板大小加減溶液用量)的培養(yǎng)皿中,浸泡15Min后,換核黃素溶液浸泡5Min;然后將膠板放入含有1MMol/LEDTA的PH7?8磷酸緩沖液中,在距膠板10CM高度用40W日光燈直射膠面,直至藍(lán)色背景上出現(xiàn)透明條帶為止。

4、過氧化氫酶同工酶染色 染色液的組成:A液為3%H2O225Ml,0?1Mol/LPH7?0磷酸緩沖液5Ml,0?1Mol/LNA2S2O33?5Ml;B液為0?09Mol/LKI25Ml加蒸餾水25Ml。先將準(zhǔn)備好的電泳膠板浸泡在A液中,室溫下放置15Min,倒出A液,用蒸餾水徹底沖洗干凈,加入B液,酶活性表現(xiàn)在藍(lán)色背景上的白色區(qū)帶。蒸餾水漂洗后用10%甘油固定。

5、可溶性蛋白的染色稱取0?2g考馬斯亮藍(lán)R250,用少量無水乙醇溶解,用含有40%乙醇和7%醋酸的水溶液稀釋至200Ml。將膠板浸入此液室溫下染色5~6H,倒去染色液,用水沖洗附著于膠面的染料,再將膠浸入脫色液中(400Ml乙醇,70Ml冰醋酸加水到1000Ml)更換脫色液幾次,直到背景清晰為止。

6、結(jié)果保存將脫過色的凝膠照相或掃描后作為實(shí)驗(yàn)報(bào)告的憑證。作為學(xué)生實(shí)驗(yàn)報(bào)告可用繪圖或制作干膠的方法記錄酶譜帶或可溶性蛋白質(zhì)的主要譜帶或用干膠片保存結(jié)果。方法如下:

干膠制備:裁下2張比膠片四邊長3CM左右的玻璃紙?jiān)谒�中浸濕�?先將一張平鋪在玻璃板上,放上凝膠片,再蓋上另一張,用玻棒趕走氣泡,將玻璃紙邊緣折向玻板底部,用另一塊同樣大小的玻璃板壓住,再用夾子夾住兩端固定,室溫下避光放置1天左右即可,然后取下干膠,修剪整齊保存。

繪圖表示:將各酶帶按顏色深淺繪成譜帶圖。

1、SOD同工酶電泳時(shí),分離膠濃度應(yīng)選擇10%,樣品提取液用50MMol/LPH7?8的磷酸緩沖液比較理想。

2、ACr和BIs是神經(jīng)性毒劑,且對(duì)皮膚有刺激作用。配制貯液、配膠、灌膠操作時(shí),要戴上醫(yī)用乳膠手套或指套,避免與皮膚接觸。只要細(xì)心操作,一般不會(huì)引起損傷。

3、ACr和BIs的純化。精確的定量分析和制備電泳需要純度更高的ACr和BIs,其提純方法如下:

(1)ACr重結(jié)晶方法 將ACr溶于50℃氯仿中(70g/L),趁熱過濾,濾液冷卻至-20℃,結(jié)晶。用冷的布氏漏斗抽濾,收集結(jié)晶?用冷氯仿淋洗結(jié)晶,真空干燥。純ACr的熔點(diǎn)為84?5±0?3℃。

(2)BIs重結(jié)晶方法 將12gBIs溶于1000Ml40~50℃的丙酮中,趁熱過濾,濾液逐漸冷卻至20℃,用冷的布氏漏斗抽濾,收集結(jié)晶。用冷丙酮淋洗,真空干燥。純BIs的熔點(diǎn)為185℃。