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雖然類似透鏡的物體可以追溯到4000年前,并且在隨后的許多世紀的光學著作中希臘人對充水球體的光學性質進行了描述(公元前5世紀),但已知最早的的簡單顯微鏡(放大鏡)的使用要追溯到13世紀透鏡在眼鏡中的廣泛使用。 已知的最早的復合顯微鏡的例子出現(xiàn)在1620年左右的歐洲,這種顯微鏡將樣品附近的物鏡和目鏡結合起來觀察真實圖像。 盡管發(fā)明者并不為人知,多年來出現(xiàn)了許多圍繞顯微鏡發(fā)明權的聲明,有幾個和荷蘭的眼鏡制造中心有關的爭論,其中包括聲稱發(fā)明者是撒迦利亞·讓桑(他的兒子聲稱)和/或撒迦利亞的父親漢斯·馬滕斯, 以及聲稱顯微鏡是由他們的鄰居和競爭對手眼鏡制造商漢斯·李柏希(他在1608年申請了第一個望遠鏡專利)在1590年發(fā)明的,另外還有聲稱顯微鏡是由移居國外的科內利斯·德雷貝爾發(fā)明的,他于1619年在倫敦被發(fā)現(xiàn)有另一個版本。 伽利略·伽利雷(有時也被稱為復合顯微鏡發(fā)明者)似乎在1610年后發(fā)現(xiàn),他可以用望遠鏡近距離焦距觀察小物體,并在看到1624年在羅馬展出的由德雷爾制造的復合顯微鏡后,建造了自己的改進版本。 喬瓦尼·費伯為伽利略于1625年提交給林肯大學的復合顯微鏡起了顯微鏡這個名字(伽利略稱之為“occhiolino”或“小眼睛”)。

現(xiàn)代光學顯微鏡的興起

直到1644年,在賈姆巴蒂斯塔·歐迪納的《德拉·莫斯卡的光之眼》中,才出現(xiàn)了第一個基于顯微鏡的有機組織顯微解剖的詳細描述。

直到16世紀60年代和70年代,顯微鏡在很大程度上仍然是一種新事物,意大利、荷蘭和英國的博物學家開始用顯微鏡研究生物學。意大利科學家馬爾切洛·馬爾皮吉,被一些生物學歷史學家稱為組織學之父,他開始了對肺部生物結構的分析。羅伯特·胡克的《微生物學》產生了巨大的影響,主要是因為它令人印象深刻的插圖。安東尼·范·列文虎克也做出了重大貢獻,他用簡單的單透鏡顯微鏡實現(xiàn)了300倍的放大,把一個非常小的玻璃球透鏡夾在鉚接在一起的兩塊金屬板的孔之間,并用一個可調節(jié)的螺絲針固定樣本。 然后,范·列文虎克重新發(fā)現(xiàn)了紅細胞(在簡·斯瓦默達姆之后)和精子,并幫助普及了顯微鏡觀察生物超微結構的應用方法。1676年10月9日,范·列文虎克報道了微生物的發(fā)現(xiàn)。

光學顯微鏡的性能取決于聚光透鏡系統(tǒng)的質量和正確使用,聚光透鏡系統(tǒng)將光聚焦在樣本上,物鏡系統(tǒng)用于捕獲來自樣本的光并形成圖像。 早期的儀器受到許多限制,直到19世紀末20世紀初電燈成為光源,這一原理得到了充分的重視與發(fā)展。1893年8月,柯勒提出了樣品照明的關鍵原理——柯勒照明,這是達到光學顯微鏡分辨率理論極限的關鍵。這種樣本照明方法產生均勻的光線,并克服了早期樣本照明技術所帶來的有限對比度和分辨率。樣品照明的進一步發(fā)展來自于弗里茨·塞爾尼克在1953年發(fā)現(xiàn)的相位對比度,以及喬治·諾曼斯基在1955年發(fā)現(xiàn)的差分干涉對比度照明；兩者都允許對未染色的透明樣品成像。

電子顯微鏡

在20世紀早期,光顯微鏡的一個重要替代物被開發(fā)出來,這是一種使用電子束而不是光來產生圖像的儀器。德國物理學家恩斯特·羅斯卡(Ernst Ruska)與電氣工程師馬克斯·諾爾(Max Knoll)合作,于1931年開發(fā)了第一臺原型電子顯微鏡——透射電子顯微鏡。透射電子顯微鏡的工作原理與光學顯微鏡相似,但是用電子代替光,用電磁鐵代替玻璃透鏡。使用電子而不是光,可以獲得更高的分辨率。

透射電子顯微鏡是在1935年由馬克斯·諾爾(Max Knoll)開發(fā)的掃描電子顯微鏡之后迅速發(fā)展起來的。 雖然透射電子顯微鏡在二戰(zhàn)前已被用于研究,并在二戰(zhàn)后開始變得流行,但掃描電子顯微鏡直到1965年才開始商業(yè)化。

透射電子顯微鏡在第二次世界大戰(zhàn)后變得流行起來。在西門子工作的恩斯特·羅斯卡(Ernst Ruska)開發(fā)了第一臺商用透射電子顯微鏡,并在20世紀50年代開始舉行關于電子顯微鏡的重大科學會議。1965年,查爾斯·奧茨利爵士和他的研究生加里·斯圖爾特(Gary Stewart)開發(fā)了第一臺商用掃描電子顯微鏡,劍橋儀器公司將其銷售為“立體掃描儀”。

關于使用電子顯微鏡的最新發(fā)現(xiàn)之一是其識別病毒的能力。 由于這種顯微鏡能產生可見、清晰的小細胞器圖像,因此在電子顯微鏡中不需要試劑就可觀察病毒或有害細胞,從而更有效地檢測病原體。

掃描探針顯微鏡

1981年到1983年間,格爾德·賓寧和海因里�！ち_雷爾在瑞士蘇黎士的國際商用機器公司研究量子隧道現(xiàn)象。他們發(fā)明了一種實用的儀器：一種基于量子隧道理論的掃描探針顯微鏡,利用它可以讀取探針和樣品表面之間非常小的相互作用力。由于探針非常接近表面,電子可以在探針和樣品之間連續(xù)流動從而產生從樣品表面到探針的電流。由于基礎理論的復雜性,顯微鏡最初并沒有得到廣泛接受。1984年,杰瑞·特索夫和戴德·哈曼在新澤西默里山的AT&T貝爾實驗室發(fā)表文章,將理論與儀器獲得的實驗結果聯(lián)系起來。緊接著,1985年,功能性商用儀器問世,1986年,格爾德·賓寧、夸特和戈貝爾發(fā)明了原子力顯微鏡,隨后賓尼格和羅勒因為SPM而獲得了諾貝爾物理學獎。

隨著加工超細探針和針尖能力的提高,新型掃描探針顯微鏡不斷發(fā)展。

熒光顯微鏡

光學顯微鏡的最新發(fā)展主要集中在生物學中熒光顯微鏡的興起。 在20世紀最后幾十年,特別是在后基因組時代,發(fā)展了許多細胞結構熒光染色技術。 主要的技術組包括特定細胞結構的靶向化學染色,例如,用化合物DAPI標記DNA,與熒光報道基因結合的抗體的應用,例如免疫熒光,以及熒光蛋白,如綠色熒光蛋白。 這些技術使用不同的熒光團在分子水平上分析活樣品和固定樣品的細胞結構。

熒光顯微鏡的興起推動了一種主要的現(xiàn)代顯微鏡——共焦顯微鏡的發(fā)展。該原理于1957年獲得馬文·明斯基專利,盡管激光技術限制了該技術的實際應用,直到1978年,托馬斯和克里斯托弗·克雷默才開發(fā)出第一臺實用的共焦激光掃描顯微鏡,這項技術在20世紀80年代迅速普及。

超分辨率顯微鏡

目前許多關于光學顯微鏡技術的研究(在21世紀早期)集中在熒光標記樣品的超分辨率分析的發(fā)展上。結構照明可以將分辨率提高大約2到4倍,像受激發(fā)射損耗(STED)顯微鏡技術正在接近電子顯微鏡的分辨率, 這是因為衍射極限來自于光或由激發(fā)產生,使得分辨率必須加倍才能達到超飽和。斯特凡·赫爾和埃里克·白茲格、威廉·摩爾納因STED對技術發(fā)展的貢獻獲得了2014年諾貝爾化學獎,他們將熒光顯微鏡用于單分子可視化。

x光顯微鏡

x光顯微鏡是使用電磁輻射的儀器,通常在軟x光波段對物體成像。20世紀70年代早期,x光透鏡光學技術的進步使該儀器成為可行的成像選擇。 它們經常被用于斷層攝影(見微型計算機斷層攝影),以產生物體的三維圖像,包括尚未化學固定的生物材料。目前關于改善具有更大穿透力的硬x光的光學性能的研究正在進行中。

顯微鏡可以分成幾個不同的類別。一種是基于與樣品相互作用產生圖像的因素,即光或光子(光學顯微鏡)、電子(電子顯微鏡)或探針(掃描探針顯微鏡)；或者是根據(jù)它們是通過掃描點分析樣品(共焦光學顯微鏡、掃描電子顯微鏡和掃描探針顯微鏡)還是一次性分析樣品(寬視場光學顯微鏡和透射電子顯微鏡)來分類。

廣角光學顯微鏡和透射電子顯微鏡都使用透鏡理論(光學顯微鏡和電磁透鏡),以放大透射通過樣品或被樣品反射的波所產生的圖像,使用的波是電磁波(在光學顯微鏡中)或電子束(在電子顯微鏡中)。這些顯微鏡的分辨率受到對樣品成像的輻射波長的限制,較短的波長可以獲得較高的分辨率。

像共焦顯微鏡和掃描電子顯微鏡一樣,掃描光學顯微鏡和電子顯微鏡使用透鏡將光點或電子聚焦到樣品上,然后分析光束與樣品相互作用產生的信號。然后在樣本上掃描該點,以分析某個矩形區(qū)域。圖像的放大是通過在相對較大的屏幕上顯示掃描較小的樣本區(qū)域來實現(xiàn)的。這些顯微鏡具有與寬視場光學顯微鏡、探針顯微鏡和電子顯微鏡相同的分辨率極限。

掃描探針顯微鏡也分析樣品中的一個點,然后在矩形樣品區(qū)域上掃描探針以建立圖像。由于這些顯微鏡不使用電磁或電子輻射成像,因此它們不受與上述與光學和電子顯微鏡類似的分辨率限制。

光學的

最常見的顯微鏡類型(也是最早發(fā)明的)是光學顯微鏡。這是一種包含一個或多個透鏡的光學儀器,可以產生放置在焦平面上的樣品的放大圖像。光學顯微鏡有折射玻璃(偶爾有塑料或石英),用來將光線聚焦在眼睛上或另一個光檢測器上�；�于鏡子的光學顯微鏡以同樣的方式工作。假設可見光范圍,光學顯微鏡的典型放大倍數(shù)高達1250倍,理論分辨率極限約為0.250微米或250納米。 這將實際放大倍數(shù)限制在1500倍左右。專業(yè)技術(如掃描共聚焦顯微鏡、垂直掃描顯微鏡)可能會超過此放大倍數(shù),但分辨率受到衍射限制。使用較短波長的光,如紫外線,是提高光學顯微鏡空間分辨率的一種方法,近場掃描光學顯微鏡也是如此。

Sarfus是一種最新的光學技術,它將標準光學顯微鏡的靈敏度提高到可以直接觀察納米薄膜(低至0.3納米)和孤立納米物體(低至2納米直徑)的程度。該技術基于交叉偏振反射光顯微鏡使用非反射基底。

紫外光能夠分辨微觀特征,并對肉眼透明的樣品成像。近紅外光可用于顯現(xiàn)嵌入鍵合硅器件中的電路,因為硅在該波長范圍內是透明的。

在熒光顯微術中,從紫外線到可見光的許多波長的光可以用來使樣品發(fā)出熒光,并用眼睛或特別敏感的照相機觀察。

與相差顯微鏡(右)相比,典型明視野(左)觀察到的未染色細胞。

相襯顯微鏡”是一種光學顯微鏡照明技術,其中穿過透明樣品的光的小相移被轉換成圖像中的振幅或對比度變化。 使用相差不需要染色來觀察載玻片。這種顯微鏡技術使得研究活細胞的細胞周期成為可能。

傳統(tǒng)的光學顯微鏡最近演變成了數(shù)字顯微鏡。并非通過目鏡直接觀察物體,而是使用一種類似于數(shù)碼相機中使用的傳感器來獲得圖像,然后將圖像顯示在計算機監(jiān)視器上,代替目鏡直接觀察物體。根據(jù)應用,這些傳感器可以使用互補金屬氧化物半導體（CMOS）或電荷耦合器件（CCD）技術。

使用靈敏的光子計數(shù)數(shù)碼相機,可以獲得光線水平非常低的數(shù)字顯微鏡,以避免對脆弱的生物樣本造成損害。已經證明,提供成對糾纏光子的光源可以最小化對最光敏樣品的損壞風險。在將重影成像應用于光子稀疏顯微術中,樣品被紅外光子照射,每個光子與可見光波段的糾纏伙伴在空間上相關聯(lián),以便通過光子計數(shù)照相機進行有效成像。

電子的

兩種主要類型的電子顯微鏡是透射電子顯微鏡(TEMs)和掃描電子顯微鏡(SEMs)。 它們都有一系列電磁和靜電透鏡,可以將高能電子束聚焦在樣品上。在透射電鏡中,電子穿過樣品,類似于基本的光學顯微鏡。 這需要仔細準備樣品,因為電子被大多數(shù)材料強烈散射。樣品必須非常薄(50-100納米),電子才能通過。 用鋨和重金屬染色的細胞橫截面顯示出透明的細胞器膜和蛋白質,如核糖體。 分辨率為0.1納米,可以獲得病毒的詳細視圖(20-300納米)和一條脫氧核糖核酸鏈(2納米寬)。 相比之下,掃描電鏡有光柵線圈,用細電子束掃描大塊物體的表面。因此,樣品不一定需要切片,但需要涂上重金屬等物質。 這可以體現(xiàn)樣品表面的三維視圖像。

掃描探針

不同類型的掃描探針顯微鏡是由許多不同類型的相互作用產生的,這些相互作用發(fā)生在小探針被掃描并與樣本相互作用時。這些相互作用或模式可以被記錄或映射為表面位移的函數(shù),以形成表征圖。三種最常見的掃描探針顯微鏡是原子力顯微鏡、近場掃描光學顯微鏡(MSOM或SNOM,掃描近場光學顯微鏡)和掃描隧道顯微鏡。 原子力顯微鏡有一個細探針,通常是硅或氮化硅,附著在懸臂上；探頭在樣品表面上掃描,測量并繪制引起探針和樣品表面相互作用的力。近場掃描光學顯微鏡類似于原子力顯微鏡,但它的探頭由光纖中的光源組成,光纖頂端通常有一個供光線通過的孔。顯微鏡可以捕捉透射光或反射光,以測量表面非常局部的光學特性,通常是生物樣本的表面。掃描隧道顯微鏡的金屬尖端只有一個頂端原子；探針針尖連接到電流流經的通道上。 使用針尖在導電樣品表面上掃描,直到隧道電流流動；探針連接的計算機維持電流保持恒定,并且通過記錄探針針尖的運動形成圖像。

其他類型

掃描聲學顯微鏡使用聲波來測量聲阻抗的變化。原則上與聲納相似,它們用于探測材料子表面的缺陷,包括集成電路中的缺陷。2013年2月4日,澳大利亞工程師建造了一臺“量子顯微鏡”,提供無與倫比的精度。

顯微鏡使用方法如下：調節(jié)光源：打開顯微鏡的光源,并調節(jié)其亮度,使樣品能夠被清晰的照亮。放置試片：將要觀察的樣品放置在顯微鏡的樣品臺上,并固定好。調節(jié)物鏡：選擇合適倍數(shù)的物鏡,并將其旋入鏡頭（注：不要碰觸物鏡的表面）。調節(jié)目鏡：選擇適當倍數(shù)的目鏡,并將其旋入目鏡筒中。調節(jié)視野：將鏡頭下降,直到樣品出現(xiàn)在視野中,后轉動焦距調節(jié)旋鈕,直到樣品處于清晰的對焦狀態(tài)。調節(jié)倍數(shù)：根據(jù)需要調節(jié)物鏡和目鏡的倍數(shù),以獲得更高的放大倍數(shù)。觀察和記錄：根據(jù)需要觀察樣品的不同部位,并記錄所見所聞的內容。清洗和保養(yǎng)：觀察結束后,關閉光源和調節(jié)旋鈕,將試片取下,并用干凈的布或棉簽輕輕清潔鏡頭。以上是一般顯微鏡的使用方法,不同類型的顯微鏡可能略有不同,因此在使用前請先閱讀相關的操作手冊。